Нагаев Борис, 301 группа

5' GAATTCGGATCCAAGCATGCTCCATGGTTAAGCTTGGTACC 3'
3' CTTAAGCCTAGGTTCGTACGAGGTACCAATTCGAACCATGG 5'

EcoRI     GAATTC, G'AATTC
BamHI     GGATCC, G'GATCC
SphI      GCATGC, GCATG'C
NcoI      CCATGG, C'CATGG
HindIII   AAGCTT, A'AGCTT
KpnI      GGTACC, GGTAC'C
   
   EcoRI  BamHI    SphI    NcoI     HindIIIKpnI
5' G'AATTCG'GATCCAAG'CATGCTC'CATGGTTA'AGCTTGGTAC'C 3'

                               ген X
5' AAAAAATTCTTGATCCAGGAGGTAACC ATG CCA TAT CAC.... 
....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCAAGGCT 3'

Можно заметить почти сайт узнавания BamHI и
сайт узнавания HindIII:

             BamHI
         |   GGATCC         |  ген X
5' AAAAAATTCTTGATCCAGGAGGTAACC ATG CCA TAT CAC.... 
....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCAAGGCT 3'
                 |          AAGCTT |
                            HindIII

Вертикальными чертами отмечены границы праймеров.

   5' TTCTTGATCCAGGAGGTAAC   3' -- праймер 1

   5' TGAAGCTTTTTTGTAAGTC 3' -- праймер 2
               
С помощью праймера 1 вносится замена.
Праймер 2 замен не вносит.

Рассчитаем температуры отжига: 4*(G+C) +2*(A+T) - 5*mismatch
Праймер 1: 4*(5+4-1) + 2*(5+6) -5 = 49°C
Праймер 2: 4*(4+2) + 2*(4+9) = 50°C

Температура отжига для ПЦР - минимальная из них - 49°C

Температуры получились различающиеся, кроме того,
во втором праймере сильно больше A и T, чем G и C,
но от этого было бы сложно избавиться, так как в
последовательность попало 6 А подряд.