Нагаев Борис, 301 группа

Z - GAA TTC GGA TCC CGC ATG CCC ATG GAA GCT TTT

EcoRI     G'AATTC
BamHI     G'GATCC
SphI      GCATG'C
NcoI      C'CATGG
HindIII   A'AGCTT

    EcoRI    BamHI     SphI     NcoI     HindIII
Z - G'AA TTC G'GA TCC CG'C ATG CC'C ATG GA'A GCT TTT

                               ген X
...AACTTTTGAAATCGGAGGATACAACC ATG CCA TAT CAC .....
....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCACGGC...


Разметим интересные места в последовательности с геном:

...AACTTTTGAAATCGGAGGATACAACC ATG CCA TAT CAC .....
          111111   222222  33 333 3
                44444      66 666 6

....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCACGGC...
                            555555

1 - заготовка для сайта EcoRI
2 - заготовка для сайта BamHI
3 - заготовка для сайта NcoI
4 - заготовка для RBS (на расстоянии 8 от ATG из X, что хорошо)
5 - сайт HindIII
6 - заготовка для сайта SphI


Случай 1. Z - это промотор, хочется продуцировать белок X

В данном случае нужно будет "подхватить" RBS, так как Z его не содержит.
Чтобы RBS попал в вектор, придется использовать заготовку
сайта EcoRI (1).








        *****T************
...AACTTTTGAAATCGGAGGATACAACC ATG CCA TAT CAC .....
....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCACGGC...
                   *******************

Праймеры:
   1. TTGAATTCGGAGGATACA
   2. CGTGAAGCTTTTTTGTAAG

Встраивание будет происходить по сайтам EcoRI и HindIII


Случай 2. Z - это промотор - RBS - ATG - His-тэг,
    хочется продуцировать гексагистидиновое производное белка X

Надо проследить:
1. чтобы рамки считывания совпали и
2. чтобы вместе с вставкой не вставилась последовательность AGGA

Надо искать сайт недалеко от ATG, чтобы на 3'-конце добавилось
как можно меньше посторонних аминокислотных остатков.
Было найдено одно такое место (3 и 6 на размеченном гене).
Из этого места можно сделать сайты для NcoI или SphI, внеся
в праймеры соответствующие мутации.
Если использовать сайт SphI, на 5'-конец будут добавлены
5 посторонних аминокислотных остатков (соответствующие кодонам
GAA, TTC, GGA, TCC, CGC).
Если использовать сайт NcoI, на 5'-конец будут добавлены
7 посторонних аминокислотных остатков (соответствующие кодонам
GAA, TTC, GGA, TCC, CGC, ATG, CCC).
Лучше использовать сайт SphI.

Второй праймер можно взять тот же.

                      *****G* *** *** *** ***
...AACTTTTGAAATCGGAGGATACAACC ATG CCA TAT CAC .....
....... CCA TAG AGACTTACAAAAAAGCTTCACGGC...
                   *******************

Праймеры:
   1. TACAAGCATGCCATATCAC
   2. CGTGAAGCTTTTTTGTAAG

Встраивание будет происходить по сайтам SphI и HindIII